Desde su introducción, NGS ha superado ampliamente las capacidades de la secuenciación tradicional, conocida como secuenciación de Sanger. A diferencia de los métodos anteriores, NGS permite la secuenciación simultánea de millones de fragmentos de ADN, lo que reduce significativamente el tiempo y los costos, a la vez que aumenta la cantidad de datos generados.
La tecnología NGS es esencial para una amplia gama de aplicaciones, desde la secuenciación del genoma completo hasta estudios más específicos como la secuenciación del exoma, transcriptómica, epigenómica…
Este artículo te guiará a través de los conceptos básicos, las tecnologías actuales, las aplicaciones y los retos de NGS, con un enfoque práctico basado en nuestra propia experiencia.
Principales Tecnologías de Secuenciación NGS
Secuenciación por Síntesis (Illumina)
La secuenciación por síntesis es el método más comúnmente utilizado en NGS, dominado por las plataformas de Illumina. Esta tecnología utiliza un proceso llamado «secuenciación por síntesis», donde nucleótidos fluorescentes se incorporan a una cadena de ADN en crecimiento y se detectan mediante una cámara que captura cada paso del proceso.
Flujo de trabajo:
En primer lugar, el ADN de la muestra se fragmenta y se le añaden adaptadores específicos que cumplen tres funciones clave:
- Fijación: Permiten que los fragmentos de ADN se adhieran a la superficie de la celda de flujo durante la secuenciación.
- Amplificación: Facilitan la amplificación local de cada fragmento de ADN en la celda, creando grupos de fragmentos idénticos (clusters).
- Secuenciación: Contienen secuencias que sirven de sitio para los primers de secuenciación. Cada ciclo de síntesis añade un nucleótido a la cadena en crecimiento, emitiendo una señal fluorescente que se registra.
Ventajas:
Una alta precisión, escalabilidad, y la capacidad de generar una gran cantidad de datos.
Illumina es la opción preferida para proyectos de secuenciación del genoma completo y estudios de variación genética.
Limitaciones:
La principal limitación es la longitud de lectura, que suele ser corta (entre 50 y 300 pares de bases). Esto puede dificultar la resolución de regiones repetitivas o complejas del genoma.
Secuenciación por Ion de Semiconductores (Ion Torrent)
Esta tecnología, desarrollada por Ion Torrent, detecta la liberación de iones de hidrógeno cuando un nucleótido se incorpora en una cadena de ADN. A diferencia de la secuenciación por síntesis, no requiere nucleótidos fluorescentes, lo que hace que el proceso sea más rápido y menos costoso.
Flujo de trabajo:
Similar a Illumina, pero en lugar de usar señales fluorescentes, esta tecnología mide cambios de pH que ocurren durante la incorporación de nucleótidos.
Ventajas:
Rapidez y bajo costo, adecuado para aplicaciones donde el tiempo es un factor crítico, como en secuenciación clínica.
Limitaciones:
Menor precisión en comparación con Illumina, especialmente en la detección de variaciones genéticas complejas.
Tecnologías de Tercera Generación: PacBio y Oxford Nanopore
Las tecnologías de tercera generación, como Pacific Biosciences (PacBio) y Oxford Nanopore, representan un avance significativo en la secuenciación, permitiendo lecturas mucho más largas y sin la necesidad de amplificación.
PacBio:
Utiliza secuenciación en tiempo real (SMRT), donde una molécula de ADN pasa a través de una polimerasa fijada a una superficie, permitiendo lecturas de longitud ultra larga (hasta 20 kb o más).
Ideal para estudiar variaciones estructurales, regiones repetitivas y para la secuenciación de genomas completos de novo.
Oxford Nanopore:
Esta tecnología permite la secuenciación de moléculas individuales de ADN a medida que pasan a través de un poro de proteína.
Es altamente portátil y permite la secuenciación en tiempo real con lecturas de longitud variable.
- Ventajas: Lecturas largas que permiten resolver regiones complejas del genoma, útil para la secuenciación de genomas completos, estudios de haplotipos y análisis de variaciones estructurales.
- Limitaciones: Costos elevados, mayor tasa de error en comparación con tecnologías de segunda generación, por ser las soluciones más modernas y avanzadas.
Flujo de Trabajo en NGS
Recolección y Preparación de Muestras
El proceso de NGS comienza con la recolección de muestras biológicas, que pueden incluir ADN, ARN o ambos, dependiendo de los objetivos del estudio. Las muestras pueden provenir de diversas fuentes, como sangre, tejido, células cultivadas, o incluso muestras ambientales.
